Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » Progettazione, sviluppo e terapia di farmaci » Volume 16Autori Hu Y, Tang W, Liu W, Hu Z, Pan CPubblicato il 31 maggio 2022 Volume 2022:16 Pagine 1605—1620DOI https://doi.org/10.2147/DDDT.S360346Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditor che ha approvato la pubblicazione: Dr Tin Wui WongYonghui Hu,1,2,* Wangna Tang,1,2,* Wenjie Liu,1,2 Zhibo Hu,1,2 Congqing Pan1,2 1NHC Key Laboratory of Ormoni e Sviluppo, Tianjin Key Laboratory of Metabolic Diseases, Chu Hsien- I Memorial Hospital & Tianjin Institute of Endocrinology, Tianjin Medical University, Tianjin, Repubblica popolare cinese;2Tianjin Key Laboratory of Metabolic Diseases, Tianjin Medical University, Tianjin, 300134, People's Republic of China *Questi autori hanno contribuito in egual modo a questo lavoro Corrispondenza: Congqing Pan, NHC Key Laboratory of Hormones and Development, Tianjin Key Laboratory of Metabolic Diseases, Chu Hsien- I Memorial Hospital & Tianjin Institute of Endocrinology, Tianjin Medical University, Tientsin, People's Republic of China, Email [email protected] Background: la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) gioca un ruolo importante nella deposizione della matrice interstiziale e nella fibrosi renale nella malattia renale diabetica ( DKD).È stato verificato che l'astragaloside IV (AS-IV) è benefico per il miglioramento della DKD.Tuttavia, i meccanismi alla base dell'AS-IV sulla regolamentazione dell'EMT in DKD devono ancora essere stabiliti.Prove accumulate hanno suggerito che il ligando 1 del motivo C-X3-C (CX3CL1) svolge un ruolo significativo nella progressione dell'EMT.Scopo: Abbiamo mirato a indagare se AS-IV potesse alleviare l'EMT regolando CX3CL1 in DKD e rivelarne i meccanismi sottostanti.Metodi: Per lo studio in vivo, i topi sono stati divisi nei seguenti cinque gruppi (n=10): db/m+veicolo, db/db+veicolo, db/db+AS-IV-L (10 mg/kg/giorno) , db/db+AS-IV-M (20mg/kg/giorno), db/db+AS-IV-H (40mg/kg/giorno).Dopo 12 settimane di trattamento, le lesioni renali sono state valutate sulla base dei relativi parametri di urina, sangue ed esame istopatologico.L'immunoistochimica e il Western blotting sono stati utilizzati per rilevare i livelli di proteine ​​relative.Quindi nelle cellule HK-2 è stato studiato il meccanismo molecolare dell'AS-IV che attenua l'EMT nei topi con DKD attraverso il percorso CX3CL1-RAF/MEK/ERK.RISULTATI: Nel presente studio, abbiamo scoperto che AS-IV riduce i livelli di proteine ​​urinarie e migliora il danno patologico renale nei topi DKD.Inoltre, AS-IV ha migliorato l'EMT tubulare renale indotto dall'iperglicemia o dall'alto glucosio (HG) e ha ridotto l'espressione di CX3CL1 e ha inibito l'attivazione della via RAF/MEK/ERK in vivo e in vitro.Nelle cellule HK-2, la downregulation di CX3CL1 ha soppresso la stimolazione del percorso RAF/MEK/ERK e l'EMT indotta da HG.Tuttavia, la sovraespressione di CX3CL1 ha eliminato i vantaggi di AS-IV sul percorso RAF/MEK/ERK e sull'EMT.Conclusione: In sintesi, abbiamo indicato che AS-IV allevia l'EMT tubulare renale attraverso la via di segnalazione CX3CL1-RAF/MEK/ERK, indicando che CX3CL1 potrebbe essere un potenziale bersaglio terapeutico di AS-IV in DKD.Parole chiave: astragaloside IV, transizione epiteliale-mesenchimale, CX3CL1, malattia renale diabetica, fibrosi renaleLa malattia renale diabetica (DKD) è ancora la complicanza microvascolare più comune del diabete e la causa principale che porta alla malattia renale allo stadio terminale (ESRD) nel mondo.Secondo la ricerca epidemiologica in tutto il mondo, il 30-50% dell'ESRD è causato approssimativamente da DKD.1 È stato riferito che il DKD è diventato la principale causa di ESRD nelle persone di mezza età e negli anziani in Cina.2 Per ritardare la progressione della DKD, gli studi con blocco precoce o con doppio sistema renina-angiotensina-aldosterone (RAAS), antagonisti del recettore dell'endotelina e l'antiossidante bardoxolone sono stati effettuati negli ultimi decenni, ma sfortunatamente nessuno ha prodotto risultati soddisfacenti.3 Pertanto, è significativo guardare per obiettivi terapeutici più efficaci e interventi per prevenire o trattare la DKD per ridurre ulteriormente la prevalenza di ESRD in futuro.4 È stato stabilito che la fibrosi tubulo-interstiziale è una lesione patologica essenziale nella progressione della DKD.5,6 Il danno renale prolungato indotto da iperglicemia o stress ossidativo provoca infiammazione renale, sovraespressione di fattori profibrotici e proliferazione dei miofibroblasti, seguita da un eccessivo accumulon dei componenti della matrice extracellulare (ECM), distruzione del sistema vascolare renale e, infine, fibrosi renale.7 La graduale trasformazione delle cellule tubulari renali da un fenotipo epiteliale a un fenotipo mesenchimale è la principale caratteristica patologica della transizione epiteliale-mesenchimale renale (EMT).In questa trasformazione, le cellule tubulari renali perdono caratteristiche epiteliali, come la riduzione dell'espressione di E-caderina, e acquisiscono caratteristiche mesenchimali, come una maggiore espressione di vimentina e α-SMA.8 Recentemente, l'EMT delle cellule tubulari renali è stata riconosciuta come la più causa comune di indurre una funzione renale compromessa e un'alterazione patogena cruciale per lo sviluppo della fibrosi tubulointerstiziale nella DKD.9 Pertanto, l'inibizione dell'EMT delle cellule tubulari renali può essere un intervento efficace per ritardare la progressione della DKD.È stato dimostrato che il ligando 1 del motivo C-X3-C (CX3CL1), noto anche come frattalkina (FKN), partecipa alle risposte immunitarie infiammatorie.E costituisce l'unico membro della superfamiglia delle chemochine CX3C che è coinvolto nell'adesione cellulare e nella regolazione della crescita cellulare.10 CX3CL1 rappresenta uno dei fattori correlati al danno tissutale e all'aggregazione delle cellule immunitarie nell'area del danno.11 È stato ha suggerito che livelli plasmatici più elevati di CX3CL1 fossero associati ai tradizionali fattori di rischio cardiovascolare, malattie cardiovascolari prevalenti (CVD) e diabete mellito (DM) negli adulti con malattia renale cronica (CKD).12 Inoltre, un numero crescente di prove ha suggerito che CX3CL1 giochi un ruolo significativo nella progressione della malattia di DKD.13,14 Un'indagine precedente ha rivelato che CX3CL1 è sovraregolato nei tessuti renali degli animali diabetici e nei capillari glomerulari e peritubulari.15 Kikuchi et al hanno indicato che livelli elevati di glucosio, AGE e attivazione di citochine sovraregolano il espressione di CX3CL1 nei glomeruli di ratto e portano allo sviluppo di DKD.16 Inoltre, è stato riportato che la proteina si sovraccaricad porta alla sovraregolazione di CX3CL1 nelle cellule epiteliali tubulari prossimali attraverso vie NF-κB e p38-MAPK-dipendenti.17 Recentemente, Fu et al hanno rivelato l'esistenza di un asse CX3CL1-Wnt/β-catenina-EMT che ha stimolato l'alterazione EMT in i reni di topi MRL/lpr e cellule HK-2.10 Inoltre, uno studio precedente ha suggerito che CX3CL1 promuove l'EMT e induce l'aumento dell'invasività e delle metastasi nelle cellule di cancro alla prostata ipossiche androgeno-indipendenti.18 Evidenze accumulate suggeriscono anche un ruolo importante per la via di segnalazione RAF/MEK/ERK nella regolazione dell'EMT in molteplici malattie,19,20 inclusa la DKD.21 Tuttavia, non è chiaro se la via di segnalazione RAF/MEK/ERK sia coinvolta nell'EMT indotta da CX3CL1 nella DKD.I prodotti naturali sono una significativa risorsa pronta per la scoperta e lo sviluppo di nuovi farmaci, molti dei quali potrebbero avere potenziali benefici contro la DKD.L'astragaloside IV (AS-IV) è una saponina naturale abbondante nell'Astragalus mongholicus Bunge ed esibisce un'ampia gamma di attività biologiche.Numerosi studi hanno illustrato il ruolo di protezione renale dell'AS-IV, inclusa la soppressione dell'infiammazione renale,22 l'inibizione della fibrosi tubulointerstiziale renale e la protezione dei podociti.23 Studi recenti mostrano che l'AS-IV migliora la fibrosi tubulointerstiziale renale, che non era solo correlata a inibizione dell'EMT tubulare e dell'attivazione dei fibroblasti, ma anche associata a un aumento della produzione di NO nel rene.7 Tuttavia, non è ancora chiaro se l'AS-IV possa inibire l'espressione di CX3CL1 e inibire ulteriormente l'EMT per alleviare la fibrosi renale in vivo e in vitro.Questo studio mirava a valutare i benefici di AS-IV sull'EMT delle cellule epiteliali tubulari renali e sulla fibrosi renale nella DKD e di chiarire i meccanismi alla base di questi effetti.Nel presente studio, topi maschi di 8 settimane db/db (C57BLKS/J-leprdb/leprdb) sono stati selezionati come modello per il diabete mellito di tipo 2 (T2DM) e topi eterozigoti di controllo db/m sono stati utilizzati come controllo normale .Tutti gli animali sono stati acquistati da Jiangsu Jicui Yikang biotechnology co.LTD (Nan Jing, Cina).I topi sono stati allevati in condizioni specifiche esenti da agenti patogeni.La presente indagine è stata approvata dal Comitato Etico Sperimentale sugli Animali dell'Università di Medicina di Tianjin e tutte le procedure relative agli animali hanno rispettato le linee guida della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health e le linee guida del Benessere degli animali Atto.I topi db/db sono stati assegnati in modo casuale in quattro gruppi (n=10 per gruppo): db/db+ veicolo, db/db+AS-IV-L, db/db+AS-IV-M, db/db+AS- IV-H.Il gruppo AS-IV-L, il gruppo AS-IV-M e il gruppo AS-IV-H sono stati trattati con AS-IV (rispettivamente 10, 20 e 40 mg/kg/giorno), il gruppo di controllo normale db/m2 (n= 10) e controllo sperimentale db/db trattato con lo stesso veicolo volumetrico.L'AS-IV disciolto in carbossimetilcellulosa sodica (CMC; Yuanye, Cina), è stato somministrato mediante sonda gastrica giornaliera a tre gruppi di trattamento dell'AS-IV.Il periodo di trattamento per tutti i topi è stato di 12 settimane.Al termine dell'intervento, sono state utilizzate singole gabbie metaboliche per raccogliere campioni di urina di topi nelle 24 ore durante gli ultimi tre giorni dell'esperimento.Quindi tutti i topi sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital e sacrificati.Dopo aver raccolto il sangue dal loro plesso venoso retroorbitale per l'analisi biochimica, i loro reni sono stati immediatamente raccolti per ulteriori esperimenti.Un tessuto di ciascun topo è stato conservato in formalina e utilizzato per l'analisi istologica e l'altro rene è stato congelato rapidamente a -80°C.La concentrazione sierica di CX3CL1 è stata rilevata con un kit ELISA (MM-44874M2, MEIMIAN, Cina) e il rilevamento è stato condotto secondo le istruzioni del produttore.Abbiamo aggiunto i campioni di siero diluiti cinque volte alla piastra ELISA che è stata pre-rivestita, quindi l'anticorpo marcato con l'enzima è stato aggiunto dopo l'incubazione per due ore.Dopo che la lastra è stata lavata cinque volte, è stato aggiunto il substrato per lo sviluppo del colore, quindi è stato utilizzato un lettore di micropiastre (Bio-Rad, USA) a 450 nm per rilevare l'assorbanza.Abbiamo acquistato cellule epiteliali tubulari prossimali umane (HK-2) da American Type Culture Collection (ATCC).Le cellule sono state coltivate in un mezzo DMEM (C11885500BT, Gibco, USA) contenente il 10% di siero bovino fetale (10091–148, Gibco, USA), 200 U/mL di penicillina e 200μg/mL di streptomicina (C125C5, NCM Biotech, Cina) .La concentrazione di anidride carbonica nell'incubatrice era del 5% e la temperatura è stata mantenuta a 37°C in atmosfera umidificata.Le cellule sono state assegnate in gruppi come segue: (1) il gruppo glucosio normale (NG) è stato mantenuto in DMEM contenente 5,5 mM di glucosio, (2) il gruppo mannitolo (MA) è stato coltivato in DMEM contenente 5,5 mM di glucosio e 27,8 mM di mannitolo, (3) le cellule nel gruppo ad alto contenuto di glucosio (HG) sono state coltivate in DMEM contenente 33,3 mM di glucosio e (4) il gruppo HG + AS-IV è stato incubato in DMEM contenente 33,3 mM di glucosio con 40 μM di AS-IV.I quattro gruppi sono stati mantenuti per 48 ore in condizioni diverse.Le concentrazioni di glucosio (33,3 mM) sono state utilizzate in base allo studio precedente.8 E abbiamo selezionato le concentrazioni di AS-IV (40 μM) in base ai risultati di un test del kit di conteggio cellulare 8 (CCK8) (Figura S1).Le cellule sono state incubate con diverse concentrazioni di AS-IV a 0, 5, 10, 20, 40, 80, 120 e 160μM in un mezzo di glucosio alto (33,3 mM) per 24 ore.Ogni gruppo comprendeva quattro vice-pozzi.E le cellule sono state coltivate in un'incubatrice come sopra descritto.Quindi i reagenti inclusi 100μL di mezzo DMEM e 10μL di CCK-8 sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e le operazioni sono state eseguite al buio.Ad una lunghezza d'onda di 450 nm, il lettore di micropiastre (Bio-Rad, USA) è stato utilizzato per esaminare l'assorbanza.Abbiamo tagliato le sezioni seriali di 4 μm di spessore da blocchi di paraffina e le sezioni sono state colorate con kit di colorazione ematossilina ed eosina (H&E) (G1120, Solarbio, Cina), kit di colorazione tricromica di Masson (Masson) (G1346, Solarbio, Cina), periodico kit di colorazione acido-argento metenamina (PASM) (G1790, Solarbio, Cina) e kit di colorazione acido periodico-Schiff (PAS) (G1360, Solarbio, Cina).Le aree di almeno 60 profili di ciuffi glomerulari per campione sono state misurate utilizzando il sistema di analisi delle immagini interattivo Image-Pro Plus 6.0, da cui è stata valutata l'area glomerulare media (mGA).La percentuale di aree glomerular-positive con colorazione PAS (area mesangiale frazionaria [fMA]) è stata stimata a una soglia di colore fissa definendo prima i glomeruli come area di interesse, che è stata determinata identificando da tre a cinque singoli pixel nelle regioni di PAS- colorazione positiva.Infine, l'Area mesangiale media (mMA) è stata calcolata secondo la formula: (fMA×mGA)/100.L'immunoistochimica è stata condotta per analizzare l'espressione delle proteine ​​renali correlate all'EMT.Inoltre, considerando che CX3CL1 è una chemochina coinvolta nella risposta immunitaria infiammatoria, abbiamo anche esaminato l'espressione dei fattori infiammatori dell'interstizio renale.Le sezioni renali incluse in paraffina sono state deparaffinate utilizzando xilene, idratate con etanolo graduato, il recupero dell'antigene è stato eseguito a 95°C per 10 minuti, quindi bloccato con 3% H2O2 e incubato per una notte a 4°C con gli anticorpi primari come segue: anti -E-caderina (1:50, A11492, ABclonal, Cina), anti-vimentina (1:100, 10366-1-AP, Proteintech, Cina) e anti-α-SMA (1:50, 55135-1- AP, Proteintech, Cina), anti-IL-1β (1:50, 16806-1-AP, Proteintech, Cina), anti-IL-18 (1:50, 10663-1-AP, Proteintech, Cina).Il giorno successivo, le sezioni sono state incubate con anticorpi secondari IgG anti-coniglio biotinilati di capra (LK2001, entrambi 1:200, Sungene Biotech, Cina) per un'ora.Il cromogeno diamino-benzidina (DAB) è stato utilizzato per osservare la condizione di etichettatura e le sezioni sono state colorate di contrasto con ematossilina per la colorazione nucleare.Le sezioni sono state analizzate utilizzando il sistema di analisi delle immagini Image-Pro Plus 6.0.Per la preparazione dei lisati proteici totali, i tessuti renali sono stati raccolti per l'estrazione delle proteine ​​mediante tampone di lisi RIPA (P0013C, Beyotime, Cina) contenente inibitori della proteinasi e della fosfatasi (ST506, Beyotime, Cina).Dopo la macinazione per tre minuti, l'omogenato di rene è stato centrifugato per 15 minuti e sono stati raccolti i supernatanti per la misurazione delle proteine.Le frazioni proteiche totali sono state quantificate utilizzando il kit BCA (Thermo Fisher, Cat: 34580).Quindi, dopo essere stato lavato con acqua a 95 ℃ per 10 minuti, è stato conservato in un frigorifero a -20 ℃ per la successiva analisi di Western Blotting.Il tampone di lisi RIPA contenente PMSF, inibitori della fosfatasi e tampone di carico è stato utilizzato per estrarre le proteine ​​dei tessuti cellulari e renali.Quindi abbiamo caricato quantità uguali di campioni proteici su gel SDS-PAGE e li abbiamo trasferiti su membrane di nitrocellulosa (NC).Dopo aver bloccato in latte al 5% per un'ora, le membrane sono state lavate con TBST per tre volte, ciascuna per 10 minuti, e quindi sono state incubate a 4 °C per una notte con anticorpi primari, tra cui: anti-E-caderina (1:1000, A11492, ABclonal, Cina), anti-vimentina (1:2000, 10366-1-AP, Proteintech, Cina) e anti-α-SMA (1:1000, 55135-1-AP, Proteintech, Cina), anti- CX3CL1 (1:1000, A14198, ABclonal, Cina), anti-c-Raf (1:1000, 9422T, CST, USA), anti-fosfo-c-Raf (Ser338) (56A6) (1:1000, 9427T, CST, USA), anti-MEK1/2 (D1A5) (1:1000, 8727T, CST, USA), anti-fosfo-MEK1/2 (Ser217/221) (41G9) (1:1000, 9154T, CST, USA ), anti-p44/42 MAPK (ERK1/2) (1:1000, 9102S, CST, USA), anti-fosfo-p44/42 MAPK (ERK1/2) (Thr202/Tyr204) (1:1000, 9101S, CST, USA).Il giorno successivo, dopo il lavaggio con TBST, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari IgG anti-coniglio biotinilati di capra (entrambi 1:4000, Sungene Biotech, Cina) per un'ora.I reagenti ECL (K-12045-D50, Advansta, USA) sono stati utilizzati per osservare i segnali di chemiluminescenza.Il software ImageJ è stato condotto per quantificare le macchie.Abbiamo placcato cellule HK-2 su una piastra di coltura a 24 pozzetti per la colorazione con immunofluorescenza.Dopo un intervento rilevante, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 10 minuti e successivamente permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,1% per 30 minuti.Quindi le cellule sono state bloccate con BSA al 5% per 30 minuti.Dopo il lavaggio con PBS tre volte, ciascuna per cinque minuti, le cellule sono state incubate per una notte a 4°C con i seguenti anticorpi primari: anti-E-caderina (1:50, A11492, ABclonal, Cina), anti-vimentina (1: 50, 10366-1-AP, Proteintech, Cina) e anti-α-SMA (1:50, 55135-1-AP, Proteintech, Cina).Successivamente, le cellule sono state incubate con il corrispondente anticorpo secondario coniugato con FITC per un'ora e in DAPI per tre minuti.La piastra di coltura è stata mantenuta al buio.Infine, abbiamo utilizzato un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera digitale per acquisire l'immagine.Abbiamo utilizzato il reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, USA) per estrarre l'RNA.E abbiamo usato un kit del sistema di trascrizione inversa (O11018, TransGen Biotech, Cina) per trascrivere l'RNA raccolto in cDNA.La PCR in tempo reale è stata condotta utilizzando un sistema di rilevamento iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA. I primer utilizzati per amplificare i geni che codificano per E-caderina, vimentina, α-SMA, CX3CL1 e GAPDH per l'uso con il sistema SYBR Green sono stati acquistato da Sangon Biotech (B532955-0005, Sangon, Cina) e le sequenze di questi primer sono fornite nella Tabella 1. I livelli di espressione di mRNA relativi in ​​ciascun gruppo sono stati valutati con il metodo 2-ΔΔCT e GAPDH è stato considerato il controllo di normalizzazione.Tabella 1 Primer utilizzati per la quantificazione del trascritto mediante qPCRTabella 1 Primer utilizzati per la quantificazione del trascritto mediante qPCRLe cellule HK-2 sono state prima sottoposte a vari interventi e quindi seminate in piastre a sei pozzetti con una confluenza del 70-80%.Le ferite sono state create graffiando utilizzando punte di pipette sterili quando la confluenza ha raggiunto quasi il 100%.Il mezzo è stato scartato e le cellule sono state lavate con PBS due volte, seguite dall'aggiunta di un terreno di coltura cellulare normale fresco.L'area della ferita è stata registrata mediante microscopia ottica a 0 e 24 h.Le cellule HK-2 sono state trasfettate con un CX3CL1-siRNA (A10001, GenePharma, Cina) utilizzando il reagente di trasfezione (IV1216150, Invigentech, Cina) e i kit pReceiver-M90-CX3CL1 (EX-M0653-M90, GeneCopoeia, Guangzhou, Cina) utilizzando Vettore: pReceiver-M90-CX3CL seguendo le istruzioni del produttore.La sequenza CX3CL1-siRNA era la seguente: Avanti: 5′-GCAACAUCACGUGCAGCAATT-3′, Inverso: 5′-UUGCUGCACGUGAUUUGCTT-3'.La sequenza pReceiver-M90-CX3CL1 era la seguente: Avanti: 5'-CAGCCTCCGGACTCTAGC-3', Reverse: 5'-CTCTACAAATGTGGTATGGC-3'.Le cellule trasfettate sono state coltivate in un mezzo privo di siero durante la notte e quindi incubate con un mezzo contenente 33,3 mM di glucosio o contenente 33,3 mM di glucosio e 40 µM di AS-IV per 48 ore.Il software GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad, San Diego, CA, Stati Uniti) è stato utilizzato per l'analisi statistica.I risultati dei dati sperimentali sono riportati sotto forma di media±deviazione standard (x±DS).Un'analisi unidirezionale della varianza è stata utilizzata come base per valutare la significatività dei risultati.P<0,05 è stato considerato significativo.Ogni prova è stata ripetuta almeno tre volte.Per valutare la funzione renale dei topi DKD e gli effetti dell'AS-IV, abbiamo esaminato la creatinina sierica (Scr), l'azoto ureico (BUN), i livelli di microalbumina nelle urine delle 24 ore (24 ore-UMA) e l'indice renale misurato utilizzando apparecchiature di laboratorio standard.Il contenuto di Scr, BUN e indice renale nei topi db/db è aumentato significativamente rispetto ai topi db/m (P <0,05).Al contrario, rispetto al gruppo di controllo sperimentale, i topi trattati con AS-IV-L, AS-IV-M e AS-IV-H hanno dimostrato una significativa diminuzione di Scr e BUN (P <0,05, rispettivamente).Inoltre, rispetto ai topi db/m, i topi db/db hanno mostrato un aumento significativo dell'UMA a 24 ore (P <0,05).Anche il trattamento con AS‑IV per 12 settimane nei tre gruppi ha ridotto significativamente i livelli di UMA nelle 24 ore e la diminuzione è stata la più evidente nel gruppo con AS-IV-M (P<0,05).Tuttavia, rispetto al controllo sperimentale db/db, tre gruppi di intervento AS‑IV non hanno mostrato una diminuzione significativa della glicemia a digiuno (FPG), dei trigliceridi (TG), del colesterolo totale (TC), dell'alanina aminotransferasi (ALT), dell'aspartato aminotransferasi ( AST) livelli.(Tavolo 2).Tabella 2 Parametri fisici e biochimici dei topi sperimentaliTabella 2 Parametri fisici e biochimici dei topi sperimentaliLa colorazione H&E, Masson, PASM e PAS dei tessuti renali è stata eseguita per osservare istopatologicamente l'effetto del danno patologico renale alleviato da AS-IV nei topi DKD.L'osservazione istologica dei benefici dell'AS-IV contro il danno renale è illustrata nella Figura 1. I risultati della colorazione H&E hanno mostrato che rispetto ai topi db/m, le cellule tubulari renali prossimali erano generalmente gonfie e le cellule epiteliali tubulari renali erano vacuolate in db /db topi, mentre il trattamento con AS-IV ha migliorato significativamente questi cambiamenti patologici.La colorazione tricromica di Masson è stata utilizzata per contrastare la deposizione di collagene nei tessuti renali.Rispetto ai topi db/m, i topi db/db nel gruppo di controllo sperimentale hanno mostrato aumenti significativi nella deposizione di collagene, mentre è stato alleviato nei topi db/db trattati con AS-IV e l'effetto più evidente di AS-IV sulla renoprotezione è alla dose di 20 mg/kg/giorno.Inoltre, secondo la colorazione PASM, i topi db/db hanno mostrato in particolare ipertrofia glomerulare ed espansione della matrice mesangiale, rispetto ai topi db/m.Tuttavia, queste lesioni istopatologiche sono state notevolmente attenuate nei topi trattati con AS-IV.La glomerulopatia è stata rilevata nei topi db/db, rispettivamente con mGA, fMA e mMA significativamente più elevati.Tutti questi aumenti sono stati significativamente ridotti rispettivamente di 12 settimane di trattamento con AS-IV (Figure 2A-D).In breve, l'inibizione della fibrosi renale e il miglioramento delle lesioni renali hanno confermato che l'AS-IV ha un effetto renoprotettivo contro lo sviluppo di DKD.Figura 1 Colorazione HE, colorazione Masson e colorazione PASM per osservare i cambiamenti del volume glomerulare, l'espansione della matrice mesangiale, la sclerosi glomerulare e la fibrosi tubulointerstiziale nei reni (le stelle mostrano ipertrofia glomerulare; le frecce mostrano cellule epiteliali tubulari renali gonfie e fibrosi tubulointerstiziale).La barra della scala rappresenta 50μm.Figura 2 Colorazione PAS nel rene (A) e quantificazione di mGA (B), fMA (C) e mMA (D) (le frecce mostrano ipertrofia glomerulare ed espansione mesangiale).La barra della scala rappresenta 50μm.*P<0,05 rispetto al gruppo db/m, #P<0,05 rispetto al gruppo db/db.Figura 1 Colorazione HE, colorazione Masson e colorazione PASM per osservare i cambiamenti del volume glomerulare, l'espansione della matrice mesangiale, la sclerosi glomerulare e la fibrosi tubulointerstiziale nei reni (le stelle mostrano ipertrofia glomerulare; le frecce mostrano cellule epiteliali tubulari renali gonfie e fibrosi tubulointerstiziale).La barra della scala rappresenta 50μm.Figura 2 Colorazione PAS nel rene (A) e quantificazione di mGA (B), fMA (C) e mMA (D) (le frecce mostrano ipertrofia glomerulare ed espansione mesangiale).La barra della scala rappresenta 50μm.*P<0,05 rispetto al gruppo db/m, #P<0,05 rispetto al gruppo db/db.In questo studio, abbiamo anche rilevato l'espressione di marcatori correlati all'EMT, inclusa l'espressione di E-caderina, vimentina e α-SMA.I risultati dell'immunoistochimica hanno suggerito che i livelli di espressione di vimentina e α-SMA erano notevolmente aumentati, mentre la E-caderina era diminuita nei topi db/db rispetto ai topi db/m.Dopo la somministrazione di AS-IV, i livelli di espressione di vimentina e α-SMA sono stati parzialmente soppressi, l'espressione di E-caderina è stata parzialmente ripristinata nei topi db/db e l'effetto più notevole di AS-IV sulla renoprotezione è a un dosaggio di 20 mg/kg/giorno (Figura 3A–F).Inoltre, rispetto al gruppo db/m, l'espressione IL-1β e IL18 erano aumentate nel gruppo db/db.Tuttavia, dopo l'intervento di AS-IV, l'espressione di IL-1β e IL18 nell'interstizio renale era significativamente ridotta (P <0, 05) (Figura 4A-D).Per chiarire ulteriormente il ruolo di CX3CL1 in DKD e gli effetti anti-EMT di AS-IV in vivo, i livelli sierici di CX3CL1 nei topi sono stati rilevati dai kit ELISA.I risultati hanno indicato che il livello di espressione di CX3CL1 era significativamente aumentato nei topi db/db rispetto a quello dei topi db/m (P <0,05).E dopo l'intervento di AS-IV, i livelli sierici di CX3CL1 erano significativamente ridotti nei topi db/db (P <0,05) e la diminuzione era la più evidente nella dose di 20 mg/kg/giorno (Figure 5A).Inoltre, abbiamo anche rilevato i livelli proteici di vimentina, α-SMA ed E-caderina mediante Western blotting, che erano simili ai risultati immunoistochimici (Figure 5B e C).Inoltre, abbiamo rilevato i livelli proteici dei marcatori nella via di segnalazione RAF/MEK/ERK per studiare i meccanismi molecolari sottostanti riguardanti i benefici anti-EMT di AS-IV.Come mostrato nelle Figure 5D ed E, il rapporto tra pc-Raf e tc-Raf (pc-Raf/c-Raf), p-MEK1/2 e t-MEK1/2 (p-MEK/MEK) e p- Da ERK1/2 a t-ERK1/2 (p-ERK/ERK) nei topi db/db sono stati aumentati rispetto al gruppo db/m (P <0,05).Tuttavia, il rapporto tra i livelli di proteine ​​pc-Raf/c-Raf, p-MEK/MEK e p-ERK/ERK era significativamente diminuito nei topi trattati con AS-IV rispetto ai topi db/db senza trattamento (P <0,05).E dopo la somministrazione di AS-IV, anche i livelli di proteina CX3CL1 erano significativamente ridotti rispetto al gruppo db/db (P<0,05, rispettivamente) e la diminuzione era la più evidente nel gruppo AS-IV-M.Figura 3 Immagini rappresentative di E-caderina (A), vimentina (B) e α-SMA (C) mediante immunoistochimica dai tubuli renali e quantificazione della colorazione (rispettivamente D, E e F).La barra della scala rappresenta 50μm.*P<0,05 rispetto al gruppo db/m, #P<0,05 rispetto al gruppo db/db.Figura 4 Immagini rappresentative di IL-18 (A) e IL-1β (B) mediante immunoistochimica dai tubuli renali e quantificazione della colorazione (rispettivamente C e D).La barra della scala rappresenta 50μm.*P<0,05 rispetto al gruppo db/m, #P<0,05 rispetto al gruppo db/db.Figura 5 (A) Il livello di CX3CL1 nel siero di topi db/m o db/db (n=6 per gruppo) è stato rilevato mediante ELISA.(B) Bande rappresentative di E-caderina, vimentina e α-SMA mediante Western blot nei reni dei topi.(C) Analisi densitometrica di E-caderina, vimentina e α-SMA mediante Western blot (n = 5).(D) Bande rappresentative CX3CL1, pc-Raf, c-Raf, p-MEK, MEK, p-ERK ed ERK mediante Western blot nei reni dei topi.(E) Analisi densitometrica di CX3CL1, pc-Raf/c-Raf, p-MEK/MEK, p-ERK/ERK di Western Blot (n = 5).I dati sono espressi come media ± DS.*P<0,05 rispetto al gruppo db/m, #P<0,05 rispetto al gruppo db/db.Figura 3 Immagini rappresentative di E-caderina (A), vimentina (B) e α-SMA (C) mediante immunoistochimica dai tubuli renali e quantificazione della colorazione (rispettivamente D, E e F).La barra della scala rappresenta 50μm.*P<0,05 rispetto al gruppo db/m, #P<0,05 rispetto al gruppo db/db.Figura 4 Immagini rappresentative di IL-18 (A) e IL-1β (B) mediante immunoistochimica dai tubuli renali e quantificazione della colorazione (rispettivamente C e D).La barra della scala rappresenta 50μm.*P<0,05 rispetto al gruppo db/m, #P<0,05 rispetto al gruppo db/db.Figura 5 (A) Il livello di CX3CL1 nel siero di topi db/m o db/db (n=6 per gruppo) è stato rilevato mediante ELISA.(B) Bande rappresentative di E-caderina, vimentina e α-SMA mediante Western blot nei reni dei topi.(C) Analisi densitometrica di E-caderina, vimentina e α-SMA mediante Western blot (n = 5).(D) Bande rappresentative CX3CL1, pc-Raf, c-Raf, p-MEK, MEK, p-ERK ed ERK mediante Western blot nei reni dei topi.(E) Analisi densitometrica di CX3CL1, pc-Raf/c-Raf, p-MEK/MEK, p-ERK/ERK di Western Blot (n = 5).I dati sono espressi come media ± DS.*P<0,05 rispetto al gruppo db/m, #P<0,05 rispetto al gruppo db/db.Abbiamo anche esplorato i vantaggi anti-EMT di AS-IV nelle cellule HK-2.Come mostrato nei risultati dell'immunofluorescenza, è stato dimostrato che i livelli di vimentina e α-SMA erano significativamente aumentati e il livello di espressione di E-caderina era significativamente diminuito nel gruppo HG.Dopo l'intervento di AS-IV, l'EMT delle cellule HK-2 è stato soppresso in larga misura (Figura 6A).Successivamente, abbiamo condotto analisi qPCR e Western blot e i risultati hanno suggerito che l'intervento AS-IV ha ridotto i livelli di mRNA e proteine ​​di CX3CL1, vimentina e α-SMA e aumentato i livelli di E-caderina rispetto al gruppo HG (P <0,05 , rispettivamente) (Figura 6B–D).Inoltre, il rapporto tra pc-Raf/c-Raf, p-MEK/MEK e p-ERK/ERK era significativamente aumentato nel gruppo HG rispetto al gruppo NG, mentre il trattamento AS-IV ha ridotto significativamente questi parametri (P< 0,05) (Figure 6E e F).Per escludere l'interferenza dell'iperostosi, è stato progettato il gruppo mannitolo (MA) e non esisteva alcuna differenza significativa tra il gruppo MA e il gruppo NG.Inoltre, come mostrato dai saggi di guarigione delle ferite (Figura 7A e B), HG ha aumentato significativamente la migrazione delle cellule HK-2 e questo progresso è stato parzialmente inibito dopo l'intervento AS-IV (P <0,05).Questi risultati hanno ulteriormente dimostrato che AS-IV ha migliorato l'EMT indotto da HG tramite la via di segnalazione CX3CL1 e RAF/MEK/ERK nelle cellule HK-2.Figura 6 (A) Immagini rappresentative di E-caderina (verde), vimentina (verde) e α-SMA (verde) mediante immunofluorescenza nelle cellule HK-2.La colorazione blu si riferisce ai nuclei colorati con DAPI.La barra della scala rappresenta 100μm.(B) Quantificazione dell'espressione genica di CX3CL1, E-caderina, vimentina e α-SMA nelle cellule HK-2 (n = 4).(C) Bande rappresentative di E-caderina, vimentina e α-SMA mediante Western blot nelle cellule HK-2.(D) Analisi densitometrica di E-caderina, vimentina e α-SMA mediante Western blot (n = 4).(E) Bande rappresentative CX3CL1, pc-Raf, c-Raf, p-MEK, MEK, p-ERK ed ERK mediante Western blot nelle cellule HK-2.(F) Analisi densitometrica di CX3CL1, pc-Raf/c-Raf, p-MEK/MEK, p-ERK/ERK di Western Blot (n = 4).I dati sono espressi come media ± DS.*P<0,05 rispetto al gruppo NG, #P<0,05 rispetto al gruppo HG.Figura 7 (A) Il saggio di guarigione delle ferite è stato utilizzato per rilevare la migrazione cellulare.(B) Tasso di migrazione (%) della migrazione cellulare mediante saggio di guarigione delle ferite.*P<0,05 rispetto al gruppo NG, #P<0,05 rispetto al gruppo HG.Figura 6 (A) Immagini rappresentative di E-caderina (verde), vimentina (verde) e α-SMA (verde) mediante immunofluorescenza nelle cellule HK-2.La colorazione blu si riferisce ai nuclei colorati con DAPI.La barra della scala rappresenta 100μm.(B) Quantificazione dell'espressione genica di CX3CL1, E-caderina, vimentina e α-SMA nelle cellule HK-2 (n = 4).(C) Bande rappresentative di E-caderina, vimentina e α-SMA mediante Western blot nelle cellule HK-2.(D) Analisi densitometrica di E-caderina, vimentina e α-SMA mediante Western blot (n = 4).(E) Bande rappresentative CX3CL1, pc-Raf, c-Raf, p-MEK, MEK, p-ERK ed ERK mediante Western blot nelle cellule HK-2.(F) Analisi densitometrica di CX3CL1, pc-Raf/c-Raf, p-MEK/MEK, p-ERK/ERK di Western Blot (n = 4).I dati sono espressi come media ± DS.*P<0,05 rispetto al gruppo NG, #P<0,05 rispetto al gruppo HG.Figura 7 (A) Il saggio di guarigione delle ferite è stato utilizzato per rilevare la migrazione cellulare.(B) Tasso di migrazione (%) della migrazione cellulare mediante saggio di guarigione delle ferite.*P<0,05 rispetto al gruppo NG, #P<0,05 rispetto al gruppo HG.Per chiarire ulteriormente se l'EMT indotto da HG mediato da CX3CL1 tramite la via di segnalazione RAF/MEK/ERK, è stato costruito un modello knockout CX3CL1 nelle cellule HK-2.Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.Immunolo anteriore.Farmaco anteriore.Complemento BMC Altern Med.Eur J Pharmacol.Farmaco Ris.Farmaco anteriore.Questo lavoro è pubblicato e concesso in licenza da Dove Medical Press Limited.I termini completi di questa licenza sono disponibili su https://www.dovepress.com/terms.php e incorporano la licenza Creative Commons Attribution - Non Commercial (unported, v3.0).Accedendo all'opera accetti i Termini.Gli usi non commerciali dell'opera sono consentiti senza ulteriore autorizzazione da parte di Dove Medical Press Limited, a condizione che 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